Questo video vi spiegherà perfettamente tutto quello di cui si è parlato nel precedente post!

L'mRNA

RNA messaggero

Il "ciclo vitale" di un mRNA in una cellula eucariote. L'RNA è trascritto nel nucleo cellulare; dopo essere stato completamente modificato viene trasportato nel citoplasma e tradotto da un ribosoma. Alla fine della sua vita l'mRNA viene degradato.

L'RNA messaggero (noto con l'abbreviazione di mRNA o con il termine più generico di trascritto) è un tipo di RNA che codifica e porta informazioni durante la trascrizione dal DNA ai siti della sintesi proteica, per essere sottoposto alla traduzione.

La breve vita di una molecola di mRNA comincia con la trascrizione e termina con la degradazione. Durante la sua vita una molecola di mRNA può anche essere esaminata, modificata e trasportata prima della traduzione. Le molecole di mRNA degli eucarioti spesso richiedono di essere verificate e trasportate, al contrario di quelle dei procarioti.

Durante la trascrizione, la RNA polimerasi "copia" l'informazione contenuta in un gene sul DNA in una molecola di mRNA. Questo processo è simile nei procarioti e negli eucarioti. Una differenza notevole, invece, è che l'RNA polimerasi degli eucarioti si associa con gli enzimi di verifica dell'mRNA durante la trascrizione, in modo da far procedere velocemente la modificazione dopo l'inizio della trascrizione. Il prodotto non modificato o parzialmente modificato è chiamato pre-mRNA, che una volta modificato prende il nome di RNA maturo.

La maturazione dell'mRNA differisce molto tra gli eucarioti ed i procarioti. L'mRNA procariotico è già maturo dopo la trascrizione e non richiede di essere controllato. Il pre-RNA eucariotico invece richiede una lunga verifica.

La maturazione dell'mRNA è una serie di processi chimici che trasformano una molecola di pre-mRNA  in mRNA.

Le tappe della maturazione sono;

Splicing

Capping

Poliadenilazione

Molecole di snRNA prendono parte alla maturazione.

Per approfondire, vedi RNA editing.

L'editing è la modifica della composizione nucleotidica dell'mRNA. Un esempio nell'uomo l'mRNA della apolipoproteina B viene modificato in alcuni tessuti ma non in altri. L'editing crea un codone di stop prematuro, che sottoposto a traduzione produce una proteina più corta.

Un'altra differenza tra procarioti ed eucarioti è il trasporto dell'mRNA. Poiché negli eucarioti trascrizione e sintesi proteica avvengono in compartimenti separati, l'mRNA eucariotico deve essere trasportato dal nucleo cellulare al citoplasma. Gli mRNA maturi vengono riconosciuti mediante le loro modificazioni e poi esportati tramite il poro nucleare, trasporto mediato da proteine tra cui NXF1.

Poiché l'mRNA procariotico non necessita di essere trasportato, la sintesi proteica (avviene nel citoplasma, operata dai ribosomi) può iniziare immediatamente dopo l'inizio della trascrizione. Quindi si può dire che la traduzione procariotica è accoppiata alla trascrizione ed avviene co-trascrizionalmente.

L'mRNA eucariotico che è stato modificato e trasportato al citoplasma (detto a questo punto RNA maturo), può poi essere tradotto dal ribosoma. La traduzione può avvenire in ribosomi liberi nel citoplasma oppure nel reticolo endoplasmatico mediante una signal recognition particle. Quindi, diversamente dai procarioti, la traduzione negli eucarioti non è direttamente accoppiata alla trascrizione.

Dopo un certo lasso di tempo il messaggio si degrada nei suoi componenti nucleotidici, di solito con l'assistenza dell'mRNasi. Grazie al controllo che subisce, l'mRNA eucariotico è generalmente più stabile di quello procariotico. Per essere degradato, l'mRNA eucariotico, necessita di fattori che lo destabilizzino: tra questi fattori destabilizzanti troviamo gli elementi ARE e gli elementi IREs.Questi elementi si attivano quando si dissociano dalle proteine alle quali sono legati, attivando anche endonucleasi che catalizzano la degradazione dell'mRNA.

La struttura di un mRNA eucariotico maturo. Un mRNA completamente modificato include un cappuccio 5', un 5' UTR, una regione codificante, un 3' UTR ed una coda poli-A.

Rivestimento in 5'

Per approfondire, vedi Rivestimento in 5'.

Un cappuccio 5', chiamato anche cappuccio RNA 7-metilguanosina (o RNA7G), è un nucleotide guaninico modificato che viene aggiunto all'estremità frontale (5' terminale) dell'RNA messaggero appena dopo l'inizio della trascrizione. Consiste in un residuo terminale di 7-metilguanosina legato tramite un legame 5'-5'-trifosfato al primo nucleotide trascritto. La sua presenza è importante per il riconoscimento da parte del ribosoma e la protezione dall'RNasi.

L'aggiunta del cappuccio è contemporanea alla trascrizione. Appena dopo l'inizio della trascrizione, il 5' terminale sintetizzato è legato tramite un complesso per la sintesi del cappuccio associato con l'RNA polimerasi. Questo complesso enzimatico catalizza le reazioni chimiche necessarie. La sintesi procede come una reazione biochimica multi-step:

Viene tagliato il trifosfato del 5' terminale dell'RNA appena sintetizzato. L'enzima fosfoidrolasi taglia i legami γ fosfodiesteri lasciando i fosfati in posizione α e β.

L'enzima guanililtrasferasi trasferisce una guanina ed il suo α fosfato sul β fosfato del 5' terminale dell'RNA, producendo un legame 5'-5'-trifosfato.

La posizione dell'azoto-7 (N-7) viene metilata (guaninmetilazione) dall'enzima mRNA (guanina-N7-)-metiltransferasi.

La mRNA (nucleoside-2'-O-)-metiltransferasi metila la posizione 2' dello zucchero ribosio. Questo gruppo metile contribuisce alla stabilità dell'RNA, grazie alla protezione da un taglio reso possibile da un attacco nucleofilo del vicino idrogeno.

Durante la trascrizione, il DNA a doppio filamento produce mRNA a partire dal cosiddetto filamento senso; l'altro filamento, complementare, è detto antisenso. Con il termine mRNA antisenso, si intende un RNA complementare in sequenza con uno o più mRNA. In alcuni organismi, la presenza di un mRNA anti-senso può inibire l'espressione genetica attraverso l'appaiamento con gli specifici mRNA. Nella ricerca biochimica, questo effetto è stato usato per studiare il funzionamento dei geni, semplicemente inibendo il cromosoma studiato aggiungendo il suo mRNA anti-senso. Tali studi sono stati compiuti sul nematode Caenorhabditis elegans ed il batterio Escherichia coli.

Ecco qui un altro video sempre in italiano, che spiega i processi di traduzione e trascrizione!

RNA,DNA polimerasi

A questo punto, vi posto un video (in italiano) dove si spiega ciò che si è trattato finora!

RNA

RNA POLIMERASI

Qui di seguito vi parlerò dell'RNA polimerasi!

L'RNA polimerasi è un enzima appartenente alla classe delle transferasi, che catalizza la seguente reazione:

nucleoside trifosfato + RNAn ⇄ difosfato + RNAn+1

Con questa reazione l'enzima catalizza la sintesi di un filamento di RNA. Generalmente con il nome RNA polimerasi si identifica la RNA polimerasi-DNA dipendente che, nel processo denominato trascrizione sintetizza un filamento di RNA complementare ad uno stampo di DNA. Esistono anche RNA polimerasi-RNA dipendenti, coinvolte nel processo di replicazione del genoma di alcuni virus che possiedono un genoma ad RNA.

L'attività di sintesi della RNA polimerasi necessita dei quattro ribonucleosidi-trifosfati che entreranno a far parte della molecola di RNA (ATP, GTP, CTP e UTP) e ioni metallici (Mn2+ e Mg2+).

Il legame dell'RNA polimerasi, nei procarioti, comporta che la subunità α riconosca l'elemento a monte  nel DNA, così come il fattore σ va a riconoscere la regione da -10 a -35. Ci sono molti fattori σ che regolano l'espressione genica. Per esempio, σ70 è espresso in condizioni normali e permette che l'RNA polimerasi vada a legarsi ai geni house-keeping, mentre σ32 determina il legame dell'RNA polimerasi con i geni heat-shock. Dopo il legame col DNA, l'RNA polimerasi passa da un complesso chiuso ad un complesso aperto. Tale cambiamento comporta la separazione dei filamenti di DNA. I ribonucleotidi sono legati alle basi del filamento stampo di DNA. Davanti alla RNA polimerasi il DNA si svolge, mentre i filamenti che la polimerasi stessa si lascia dietro, si riavvolgono.

FASE DI ALLUNGAMENTO

Tale fase, comporta l'ulteriore aggiunta di ribonucleotidi e il cambiamento del complesso aperto a complesso di trascrizione. L'RNA polimerasi non può iniziare a formare trascritti troppo lunghi a causa del suo stretto legame al promotore. In questa fase iniziale si ottengono corti frammenti di RNA di circa 9 bp attraverso un processo detto trascrizione abortiva.  A questo punto, la regione del promotore a -10 fino a -35, viene distrutta e il fattore σ stacca l'RNA polimerasi. Questo permette al resto del complesso di andare avanti. Il complesso trascrizionale di 17 bp ha un ibrido DNA-RNA di 8 bp, cioè 8 coppie di basi implicano che il trascritto di RNA si leghi allo stampo di DNA. Come la trascrizione va avanti, vengono aggiunti ribonucleotidi al 3’ terminale del trascritto di RNA e il complesso di RNAP si muove lungo il DNA. L'aggiunta di ribonucleotidi al trascritto di RNA è un meccanismo molto simile alla polimerizzazione del DNA e si ritiene che queste due polimerasi siano evolutivamente correlate.

FASE DI TRASCRIZIONE 

È segnalata da elementi di controllo detti "sequenze di terminazione" o terminatori. Possiamo avere terminatori Rho-dipendenti e Rho-indipendenti. I Rho-indipendenti sono costituiti da una sequenza con simmetria bipartita: la RNA polimerasi trascrive la sequenza di terminazione che, dato che presenta questa simmetria bipartita, si ripiega a formare una forcina; si suppone che questa struttura a forcina causi terminazione perché impedisce la progressione della polimerasi. I Rho-dipendenti non hanno la catena AT dei terminatori Rho-indipendenti e molti di essi non formano strutture a forcina. Il fattore Rho si lega alla sequenza terminatore sull'RNA sintetizzata dall'RNA polimerasi. Una volta legato, Rho con l'attività ATPasica idrolizza ATP e usa questa energia per separare l'RNA dall'RNA polimerasi e dallo stampo a DNA.

Nei procarioti è presente una sola RNA polimerasi, coinvolta nel processo di trascrizione dei geni. Essa si associa di volta in volta a diverse subunità σ che gli permettono la localizzazione a livello dei promotori di specifici gruppi di geni.

Negli eucarioti sono presenti tre diverse RNA polimerasi. Tutte le polimerasi sono eteropolimeri costituiti da molte subunità differenti, che, singolarmente o in diverse combinazioni, catalizzano le fasi di inizio, di allungamento e terminazione della sintesi del polimero. Le tre polimerasi eucariotiche differiscono sia per la struttura che per la funzione dell'RNA neosintetizzato: la polimerasi-1 presiede alla sintesi degli RNA-ribosomiali, la 2 catalizza la sintesi degli RNA-messaggeri, la 3 catalizza la sintesi degli RNA di trasferimento e dei piccoli RNA-ribosomiali. Tali polimerasi sono costituite da più di 10 subunità con funzioni diverse. Il complesso di trascrizione risulta così formato, oltre che dalla polimerasi e dal DNA-stampo, anche da molti fattori proteici di trascrizione che hanno la funzione di presiedere al riconoscimento della sequenza di inizio e delle fasi successive della polimerizzazione, oltre che quella di mediare ed integrare i messaggi di repressione e derepressione della fase di trascrizione.

Duplicazione DNA.Video

Questo è un video sulla replicazione del DNA! Spero possa essere utile a capire meglio cosa sia e come avvenga!


VIDEO;CLICCA QUI

Duplicazione DNA

La duplicazione del DNA è il meccanismo molecolare attraverso cui viene prodotta una copia del DNA cellulare. Ogni volta che una cellula si divide, infatti, l'intero genoma deve essere duplicato per poter essere trasmesso alla progenie. Il meccanismo della replicazione è complesso e richiede l'intervento di numerosi enzimi e di proteine iniziatrici. Il processo di replicazione del DNA si definisce semiconservativo: il doppio filamento di DNA parentale funge da stampo per la sintesi di due filamenti figli complementari.

L'enzima basilare della replicazione è la DNA polimerasi, che catalizza il legame tra i deossiribonucleotidi trifosfato

I procarioti possiedono cinque tipi di DNA polimerasi:
DNA polimerasi I: coinvolta nella riparazione del DNA e nella rimozione degli inneschi dei frammenti di Okazaki. Possiede attività esonucleasica sia in direzione 5'->3', sia in direzione 3'->5'. Quest'ultima attività permette la lettura delle basi precedentemente unite (proofreading o "lettura delle bozze") e l'eventuale correzione in caso di errore. La velocità di polimerizzazione è di circa 14-20 nucleotidi/secondo.
DNA polimerasi II: indotta da danni al DNA per riparazione incline all'errore . Ha attività polimerasica 5'->3' ed esonucleasica 3'->5'. Velocità di polimerizzazione di circa 40 nucleotidi/secondo.
DNA polimerasi III: l'enzima principale per la replicazione, con attività polimerasica 5'->3' ed esonucleasica 3'->5' (proofreading). È attiva sia nella sintesi del filamento guida, sia in quella dei frammenti di Okazaki. Ha una struttura particolarmente più complessa delle due precedenti, risulta costituito da due nuclei, a loro volta formati da subunità α ε θ, i due nuclei sono uniti da una subunità τ ; sono inoltre presenti strutture addizionali dette subunità χ e ψ , che vanno a costituire i complessi γ o di pinza, che permettono un incremento esponenziale del processo duplicativo. Velocità di polimerizzazione di circa 250-1000 nucleotidi/secondo.
DNA polimerasi IV e DNA polimerasi V: anch'esse coinvolte nella riparazione incline all'errore.
Polimerasi negli eucarioti [modifica]
Le polimerasi degli eucarioti sono invece:
DNA polimerasi α: è associata a una primasi (enzima che sintetizza i primer di RNA) e procede all'allungamento degli RNA-primer con alcune decine di deossiribonucleotidi (circa 50-100).
DNA polimerasi β: coinvolta nella riparazione del DNA, in particolare nei processi di riparazione per escissione delle basi
DNA polimerasi γ: replica il DNA mitocondriale
DNA polimerasi δ: l'enzima principale della replicazione eucariotica. Sintetizza sia il filamento leading, sia il filamento lagging. Quando la polimerasi raggiunge il frammento di Okazaki precedentemente sintetizzato, continua a muoversi lungo il filamento stampo lagging, spostando il primer a RNA che verrà poi rimosso da una endonucleasi (FEN-1). L'interruzione tra i desossiribonucleotidi è poi saldata da una ligasi.
DNA polimerasi ε: interviene nei meccanismi di riparazione del DNA in seguito ai processi di riparazione per escissione dei nucleotidi.
DUPLICAZIONE

Enzimi coinvolti nella replicazione del DNA


Schema della forca replicativa del DNA
La replicazione del DNA inizia su specifiche sequenze dette origini di replicazione, in numero di circa 10.000 nel genoma umano e della lunghezza di migliaia di nucleotidi. Tali sequenze sono particolarmente ricche di A e T, dal momento che queste due basi si legano con soli due legami a idrogeno al posto dei tre tra G e C, e sono quindi più facilmente scindibili. Nell'uomo vi è un numero variabile di origini di replicazione su ciascuno dei cromosomi, distanziate da poche decine di migliaia sino a centinaia di migliaia di nucleotidi e durante il processo non si attiva una sola origine di replicazione per volta , ma batterie di 20-80 origini di replicazione dette unità di replicazione. Ciascuna unità di replicazione è attivata in un momento diverso della fase S o il processo richiederebbe circa 1 ora a fronte di una media reale di 8 ore. Sembra che l'attivazione immediata o tardiva delle unità di replicazione dipenda dallo stato della cromatina in cui sono immerse e non dalla velocità della DNA polimerasi che è più o meno costante. L'eucromatina è replicata all'inizio della fase S, perché più prontamente raggiungibile e meno condensata, mentre l'eterocromatina è replicata tardivamente perché più condensata ed inaccessibile. Complessi proteici chiamati ORC si legano alle origini di replicazione durante la fase G1 del ciclo cellulare, assieme ai caricatori Cdc6 e Cdt1 della DNA elicasi Mcm.L'attivazione di specifiche proteine chinasi dipendenti da ciclina nella fase S promuove il distacco di Cdc6 e Cdt1 da ORC e dalle origini di replicazione in seguito alla loro fosforilazione, che le inattiva, segnalando che la cellula sta per effettuare sintesi di DNA. Attivano inoltre Mcm e il complesso ORC fosforilandolo. Nuovi complessi prereplicativi non vengono più assemblati sino alla fase M che resetterà le fluttuazioni di Cdk che così non potranno più fosforilare le loro proteine bersaglio e quindi non potranno attivare nuove origini di replicazione.

La DNA polimerasi non può iniziare a sintetizzare DNA immediatamente, perché ha bisogno di riconoscere un'estremità 3'-OH integra e normalmente questa non esiste sul singolo filamento. Per cui, prima della sintesi da parte di questo enzima, negli eucarioti interviene la DNA polimerasi α/primasi (che è un complesso proteico composto da 4 subunuità proteiche: 2 con attività polimerasica e 2 con attività primasica). La DNA polimerasi α/primasi procede in direzione 5'-3' sintetizzando brevi tratti di RNA di una decina di nucleotidi, in seguito le subunità con attività DNA polimerasica sintetizzano un frammento di 50-100 bp di DNA formando quindi brevi tratti ibridi DNA\RNA. Negli eucarioti i primer vengono sintetizzati ogni 100 - 400 nucleotidi. A questo punto la DNA polimerasi δ ha a disposizione estremità 3'-OH a partire dalle quali sintetizzare il nuovo filamento. Sul filamento leader, in direzione 5'-3' il filamento "figlio" è sintetizzato in modo continuo, ma sul filamento ritardato non può esserlo, dal momento che le DNA polimerasi sintetizzano solo in direzione 5'-3'. Per questo motivo la sintesi è spezzata e procede in direzione 5'-3' formando a partire dai primer tratti di 100-400 bp detti frammenti di Okazaki, intervallati da nick. Il filamento ritardato è piegato all'indietro nella forcella della replicazione. Quando una DNA polimerasi incontra il 5' del frammento di Okazaki sintetizzato precedentemente si stacca e ricomincia a sintetizzare più a valle. Successivamente l'RNA primer viene degradato da diversi enzimi  e sostituito da DNA da parte della DNA Pol δ, i nick creatisi sul filamento ritardato sono uniti dalla DNA ligasi. Tali nick sono sfruttati nella correzione degli appaiamenti sbagliati diretta dal filamento. In realtà quasi tutti i passaggi sono svolti da un unico ed enorme complesso proteico di più di 1.000 kDa che si associa al DNA e lo fa scorrere sintetizzandolo, esso comprende le elicasi, le polimerasi e così via. Inoltre, siccome un giro di un'elica di DNA è costituito da 10 coppie di nucleotidi è pressoché impossibile immaginare che la forcella replicativa generata dalle elicasi giri altrettanto velocemente, per cui in realtà la topoisomerasi I interviene attaccandosi al doppio filamento e creando un nick che usa come perno per far ruotare la doppia elica; tale processo non comporta l'utilizzo di ATP a differenza delle elicasi e della DNA ligasi.
Il DNA umano si trova però normalmente avvolto a ottameri proteici (formati da istoni) detti nucleosomi per 1,7 giri e 147 coppie di nucleotidi. Ciascun nucleosoma è diviso dal successivo da un tratto di DNA linker di lunghezza variabile tra 7-80 nucleotidi, per un totale di circa 200 nucleotidi tra DNA linker e DNA avvolto sul nucleosoma. Bisogna inoltre tener conto dell'istone H1 che aiuta nel superavvolgimento del DNA e di proteine non istoniche che nel complesso hanno un peso pari agli istoni stessi. Queste formazioni proteiche costituiscono un intralcio alla velocità di replicazione già nell'eucromatina, ancor di più nell'eterocromatina dove il DNA è ulteriormente compattato. Per districare il DNA e renderlo disponibile alla sintesi agiscono dei complessi di rimodellamento della cromatina che idrolizzano ATP in ADP+P prima che intervenga l'elicasi. Tali complessi, costituite da proteine con carica negativa, distaccano il doppio filamento dal nucleosoma e lo mantengono distaccato per 10-50 millisecondi, per farlo si avvalgono dell'aiuto di chaperoni  anch'essi con carica negativa che rimuovono dall'ottamero i dimeri istonici H2A-H2B ripartendoli equamente, uno per ciascun nuovo nucleosoma in formazione una volta completata la sintesi di DNA; il tetramero H3-H4 invece non viene sostituito. Ciò significa che nel filamento neosintetizzato le modificazioni degli istoni H3-H4 sono ereditate ma soltanto in metà dei suoi nucleosomi. Il resto verrà coerentemente completato da complessi lettore-scrittore che lo ristabiliranno qual era nel filamento originario. La disposizione dell'istone H1 ristabilisce la conformazione in fibra di 30 nm della cromatina che in seguito può andare incontro ad ulteriore condensazione.